Apoptosis 細胞凋亡

 

細胞死亡方式有兩種: Apoptosis (細胞凋亡) 及 Necrosis (細胞壞死)。

 

細胞凋亡 (Apoptosis) 是生物體維持正常生理功能的一種行為,由外接收死亡訊號,或由內自發性的死亡。

 

細胞壞死 (Necrosis) 則是細胞遭受物理性、生物毒物的剌激導致細胞膜破裂,隨後引發發炎反應,而導致細胞死亡。

 

I. 細胞週期 (Cell Cycle)

主要由 CDK、 Cyclins 與 CKI 三種蛋白組成。

CDK (Cyclin-dependent Protein Kinase)

細胞週期調控中,主要執行磷酸化的激酶,受到 CKI 與 Cyclins 調節。

CKI (Inhibitor of CDK)

負責與 CDK 結合,以抑制CDK的活性。

Cyclins

細胞週期蛋白,用來活化 CDK 的活性。

 

II. 細胞增生 (Cell Proliferation )

偵測細胞增生速率

細胞增生速率對於細胞研究相當重要,包括細胞生長、細胞分化、細胞毒殺試驗… 等等,是探討細胞健康的重要指標之一。

偵測新合成 DNA

使用 BrdU 或 EdU 直接測定 DNA 合成是細胞增殖檢測的最準確方法之一,是測定物質毒性、評估藥物安全評價、細胞健康的基本方法。提供的選擇有以流式細胞儀 (Flow Cytometry)、免疫化學染色 (Immunohistochemistry) 及酵素免疫分析 (ELISA) 等方式進行,而得知細胞週期 S 期的表現。

 

III. 細胞活性 (Cell Viability)

細胞活性偵測是分析細胞生長狀況和細胞健康重要的指標之一。死細胞對於抗體有較強的非特異性結合,當進行流式細胞儀實驗的分析時,利用排除死細胞的 cell viability dye,圈選出並去除死細胞,能讓分析結果的統計更加精確。

 

IV. 細胞凋亡 (Apoptosis)

Phosphatidylserine Exposure

細胞質膜變化是在活細胞中檢測到細胞凋亡的早期指標。驗證細胞凋亡可以通過檢測磷脂醯絲氨酸(PS)的存在,其通常位於細胞質膜的表面。細胞凋亡過程中,PS 會轉移到細胞質膜的外層。Millipore 提供抗體以及螢光標記的 Annexin V(含鈣),可以用流式細胞儀和細胞成像來檢測。

粒線體膜電位改變 (Mitochondrial Permiabization)

線粒體是重要的胞器,可維持至關重要的細胞能量平衡,包含細胞死亡過程的關鍵調節因子,並在細胞氧化壓力產生的過程中發揮重要作用。線粒體膜電位的改變被認為與線粒體外膜的透透以及細胞色素 C 和其他促凋亡蛋白釋放到細胞質中有關,然後觸發凋亡級聯反應的下游事件。

Caspase Acvtivation

Caspase 的活化在細胞凋亡反應扮演著重要的角色,活化的 caspase 會進行一連串的蛋白質酶作用 (proteolysis cascade),將死亡訊號傳遞至下游,最後引發細胞凋亡。Caspase 以未活化態存在 (procaspase),當細胞凋亡的訊號啟動,procaspase 會自行裂解或被其他的蛋白脢切割而變成活化態的 caspase,進而進行一連串的下游反應。其中 caspase 8, 9, 3為此過程的關鍵角色。上游的 caspase 8 和 caspase 9 是細胞凋亡起始訊號的 caspase, caspase 8 透過不同路徑來活化 caspase 3,而活化 caspase 3 會將訊息放大傳遞至下游,最終執行細胞凋亡。

 

V. DNA片段化的現象 (DNA fragmentation)

細胞凋亡後期,細胞核內的 DNA 會被內源性核酸內切酶降解,產生 3' 末端的切口或是斷裂的 DNA 片段,使 DNA 發生片段化的現象 (DNA fragmentation)。許多人會使用 TUNEL (Terminal deoxynucleotidyltransferase dUTP Nick End Labeling) 來檢測DNA斷裂情況。在 TdT  (terminal transferase,末端轉移酶) 的作用下,使帶有螢光或 biotin 標定的核苷酸 (ex : FITC-dUTP) 連結到 DNA 片段的 3' 末端,螢光強度與 DNA 片段量成正比,藉此來偵測細胞凋亡的情況。

 

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