Lentivirus Production
基因轉殖技術
是生醫領域研究者常用的一種技術，主要的目的是表現基因，把一段外源性的 DNA 送入細胞或動物體內，進而研究基因的功能，以了解整個調控機轉，而欲把外源性基因殖入生物體內的方法,統稱為基因轉殖。一般說來，目前基因轉殖技術可分為：(1) Non-viral delivery 及 (2) Viral delivery。
Non-viral delivery
包括 cationic liposome、electroporation、 calcium phosphate precipitation…， 操作方便，但有時候因為細胞特性或試劑毒性，而有轉殖效率不佳的問題，所以研究學者有時候會採用病毒的方式送入 DNA。
Viral delivery
重組病毒系統以轉殖效率高、表現量高且可以持續性表現並且隨著世代複製而受到重視。 缺點在於其重組病毒有可能活化的潛在危險性，但重組技術隨著時間日新月異，在重組病毒的安全性上皆設定了重重的關卡，使病毒複活的機率微乎其微。
目前常使用重組病毒系統包括
- Adenovirus
- Retrovirus
- Lentivirus
SBI 的基因轉殖工具是 Lentivirus，Lentivirus 慢病毒是一種反轉錄 RNA 病毒，可以感染分裂中或不分裂的細胞，亦可以插入宿主的 genome，同時有高效率、長效性的優點，亦為目前最常用的重組病毒。
建立 Lentivirus 轉殖系統有五大要素
1
選擇欲表現基因的載體 Lentiviral vector- cDNA expression vector，可依不同的實驗目的使用 Constitutive system 或 Cumate inducible system。
2
選擇好的包裏病毒系統 Virus Packaging System-pAPCK Packing Mix 含製造 lentivirus 所需的 env、gag、pol 等構造基因，以最佳比例混合，確保產生 high titer pseudovirus。
3
把基因表現載體和包裏病毒系統一起送入細胞工廠 Transfection- Purefection，利用奈米粒子將 DNA 包圍起來，並與 lipid membrane 融合在一起，最後將 DNA 送入細胞。
4
收集細胞上清液，濃縮高效價的病毒顆粒，Virus Concentraction-PEG-it 可濃縮病毒顆粒，濃縮倍數為 10-100 倍。
5
最後把病毒送入欲研究的細胞，Virus Concentraction-PEG-it 濃縮病毒顆粒，可濃縮倍數為 10-100 倍。
Lentiviral Vector-cDNA Expression
- 主要有兩大類，Constitutive system、Cumate inducible system。
- 主要構造：cPPT/CTS 及 WPRE 基因，能夠增強病毒感染效率和基因表現。
- Selection marker 豐富，有 GFP、RFP、Puro、Neo 或 Hygro。
利用 Cumate 存在與否，控制 CymR repressor 是否與 cumate operator sequences 結合，進而影響 GOI 表現。
主要組件：Cumate、表現 CymR 的載體、表現 GOI 的載體。
Packaging System：
pPACK Packaging Plasmid Mix
- Plasmid mix 包含 env、gag、pol 等構造基因。
- 可以包裏常見的 3rd-generation lentivectors。
- 可生產出來高效價的 pseudoviral particles。
- 適用於感染 dividing 和 non-dividing cells。
Transfection reagent-PureFection
- Nano-based 轉殖試劑，對細胞毒性低，轉殖後不需更換 medium。
- 操作簡單快速，只要 15 min 即可完成。
- 適用於 plasmid or siRNA transfection。
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PureFection 的毒性比 lipid-based 的方法低，效率一樣好
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Virus concentration reagent- PEG-it™
- 提升轉染效率，是一般 polybrene 的 4-8 倍，可應用的細胞廣泛。
- 操作簡單快速。
- 對細胞無毒性，轉染後不需更換 medium。
轉染效率大大提升
