Gene Expression System

 

 

SBI Gene Expression Systems

 

  調控基因表現 (cDNA、miRNA,、shRNA)、表現報導基因,追蹤細胞或活體影像呈現。

 

載體選擇多元

依細胞種類、狀態選擇,Viral system 或 Non-viral system

依實驗設計、應用選擇,Constitutive system、Cumate-inducible system或 Imaging & Reporter vector


 依轉染效率/實驗應用,Gene Expression Systems 分為 Viral System 和 Non-Viral System

 

Viral System

Lentiviral Vectors

 

  • Constitutive system
     
  • Cumate inducible system
     
  • miRNA overexprssion & inhibition
     
  • Imaging & Reporter vector

 

AAV Expression
 

  • Constitutive system

 

Non-Viral System

PiggyBac Transposon

 

  • Constitutive system
     
  • Cumate inducible system

 

Minicircle Technology

 

  • Constitutive system
     
  • Imaging & Reporter vector

 

EEV Systems

 

  • Constitutive system
     
  • Imaging & Reporter vector

 


 

Viral System 包含兩大病毒系統:Lentivirus、AAV

 

Lentiviral Vector

 

  • 可選擇應用多元:Constitutive 及 Cumate inducible system,可表現 cDNA、shRNA、miRNA 、Reporters 等
     
  • 亦提供多種 promoters:

AAVanced™ rAAV Expression Vectors

 

不論是直接 transfection 或使用 AAV 感染都可以有效的送入欲表現的基因

 

 

 

 


 

 

 

 依實驗目的,Gene Expression Systems 則可分為 Constitutive System 和 Cumate Inducible System

 

Constitutive system (Lentivector, AAV, PiggyBac, Minicircle, EEV)

 

  • 利用 Cumate 存在與否,控制 CymR repressor 是否與 cumate operator sequences 結合,進而影響 GOI 表現。
     
  • 主要組件:Cumate、表現 CymR 的載體、表現 GOI 的載體。

 


 

 Gene Expression Systems 各式載體介紹

應用

 

  • 細胞追蹤

產品特色

 

  • 第三代 lentivector backbone,可產生高效價病毒顆粒
     
  • 載體選擇多元:
    Promoters:CMV、EF1a
    Reporters:fluorescent proteins、luciferase
    Antibiotic : puromycin、blasticidin

     
  • 產品型式:plasmid、virus

 

Single Reporter

Dual Reporters

 

依細胞種類選擇適用的 promoter 有 CMV 或 EFa

應用

 

  • 動物模型的產生和基因治療研究

產品特色

 

  • 不含 bacterial backbone,避免引起細胞免疫反應
     
  • 大幅縮短外送 DNA 長度,提高轉殖效率
     
  • 長達 2-3 星期的表現時間
     
  • 適用 in vitroin vivo 實驗

 

Minicircle DNA 製造流程

 

  1. 將目標基因接入 parental plasmid MCS 裡。 
     
  2. 利用一般 competent cells (ex: DH5α) 挑選及複製建構好的 parental plasmid。
     
  3. 將 parental plasmid 送入 arabinose-inducible E.coli strain (ZYCY10P3S2T E.coli)。 
     
  4. 利用 arabinose 誘導 E.coli 同 時 表 現 ΦC31 integrase 及 I-SceI endonuclease。 
     
  5. ΦC31 integrase 會將 parental plasmid 分為 minicircle DNA 及 bacteria backbone。 
     
  6. 由於 bacteria backbone 含有眾多 I-SceI 切位,因此會被 I-SceI 切成小片段。最後利用 plasmid midi / maxiprep kit 純化 minicircle DNA。 

 

長效性的表現,把載體送入細胞,觀察 8 天依然有高量 GFP 表現。

應用
 

  • 調控基因表現:cDNA、ShRNA 可插入 chromosome,也可以無痕移除

產品特色

 

  • 利用 non-viral、transfection-based 方式,將目標基因鑲嵌到細胞基因組裡
     
  • 適用於 human、mouse、rat 等 mammalian cells,一次 transfection 就可製造 stable cell lines
     
  • No cargo limit:欲接入的目標基因無長度大小限制
     
  • 另有誘導性表現載體形式 (Cumate-inducible vector) 可供選擇

 

  1. Super PiggyBac transponsase 把 ITR-expression cassette-ITR segment 從載體裁切出來
     

  2. 並把此 segment 插入 chromosome的 TTAA site
     

  3. Excision-only Super PiggyBac transponsase 再把此 segment 從chromosome 移出來

 

應用

 

  • 建構 iPSC 和基因治療研究

產品特色

 

  • 非病毒、非插入性、持久穩定的基因表現
     
  • 使用 CAG promoter,基因可持續高度表現於所有哺乳類細胞及 primary cells、stem cells
     
  • 另有誘導性表現載體形式 (Cumate-inducible vector) 可供選擇
     
  • 適合 iPSC reprogramming、gene therapy、表現蛋白或各種需要表現 target gene 的實驗

 

oriP/EBNA-1  會結合在宿主 chromatin  上,使載體與宿主 genome  同時複製。
隨著每一次細胞分裂,episomal plasmid 會自然減少 (最多 5%),約 10-15 次細胞分裂後,幾乎所有的 episomal plasmid 都會消失。

 

將 EEV 打到老鼠,Luciferase 高表現量持續 40 天