Gene Expression System
SBI Gene Expression Systems
調控基因表現 (cDNA、miRNA,、shRNA)、表現報導基因，追蹤細胞或活體影像呈現。
載體選擇多元
依細胞種類、狀態選擇，Viral system 或 Non-viral system
依實驗設計、應用選擇，Constitutive system、Cumate-inducible system或 Imaging & Reporter vector
依轉染效率/實驗應用，Gene Expression Systems 可分為 Viral System 和 Non-Viral System
Viral System
Lentiviral Vectors
- Constitutive system
- Cumate inducible system
- miRNA overexprssion & inhibition
- Imaging & Reporter vector
AAV Expression
- Constitutive system
Non-Viral System
PiggyBac Transposon
- Constitutive system
- Cumate inducible system
Minicircle Technology
- Constitutive system
- Imaging & Reporter vector
EEV Systems
- Constitutive system
- Imaging & Reporter vector
Viral System 包含兩大病毒系統：Lentivirus、AAV
Lentiviral Vector
- 可選擇應用多元：Constitutive 及 Cumate inducible system，可表現 cDNA、shRNA、miRNA 、Reporters 等
- 亦提供多種 promoters：
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AAVanced™ rAAV Expression Vectors
- Single 或 dual promoter 形式，有螢光或是抗生素篩選基因可選擇
- 能與任何 AAV 包裹系統相容，亦有病毒濃縮試劑 (AAVanced Concentration Reagent)
不論是直接 transfection 或使用 AAV 感染都可以有效的送入欲表現的基因
依實驗目的，Gene Expression Systems 則可分為 Constitutive System 和 Cumate Inducible System
Constitutive system (Lentivector, AAV, PiggyBac, Minicircle, EEV)
- 利用 Cumate 存在與否，控制 CymR repressor 是否與 cumate operator sequences 結合，進而影響 GOI 表現。
- 主要組件：Cumate、表現 CymR 的載體、表現 GOI 的載體。
Gene Expression Systems 各式載體介紹
應用
- 細胞追蹤
產品特色
- 第三代 lentivector backbone，可產生高效價病毒顆粒
- 載體選擇多元：
Promoters：CMV、EF1a
Reporters：fluorescent proteins、luciferase
Antibiotic : puromycin、blasticidin
- 產品型式：plasmid、virus
Single Reporter
Dual Reporters
依細胞種類選擇適用的 promoter 有 CMV 或 EFa
應用
- 動物模型的產生和基因治療研究
產品特色
- 不含 bacterial backbone，避免引起細胞免疫反應
- 大幅縮短外送 DNA 長度，提高轉殖效率
- 長達 2-3 星期的表現時間
- 適用 in vitro 或 in vivo 實驗
Minicircle DNA 製造流程
- 將目標基因接入 parental plasmid MCS 裡。
- 利用一般 competent cells (ex: DH5α) 挑選及複製建構好的 parental plasmid。
- 將 parental plasmid 送入 arabinose-inducible E.coli strain (ZYCY10P3S2T E.coli)。
- 利用 arabinose 誘導 E.coli 同 時 表 現 ΦC31 integrase 及 I-SceI endonuclease。
- ΦC31 integrase 會將 parental plasmid 分為 minicircle DNA 及 bacteria backbone。
- 由於 bacteria backbone 含有眾多 I-SceI 切位，因此會被 I-SceI 切成小片段。最後利用 plasmid midi / maxiprep kit 純化 minicircle DNA。
長效性的表現，把載體送入細胞，觀察 8 天依然有高量 GFP 表現。
應用
- 調控基因表現：cDNA、ShRNA 可插入 chromosome，也可以無痕移除
產品特色
- 利用 non-viral、transfection-based 方式，將目標基因鑲嵌到細胞基因組裡
- 適用於 human、mouse、rat 等 mammalian cells，一次 transfection 就可製造 stable cell lines
- No cargo limit：欲接入的目標基因無長度大小限制
- 另有誘導性表現載體形式 (Cumate-inducible vector) 可供選擇
How It Works
應用
- 建構 iPSC 和基因治療研究
產品特色
- 非病毒、非插入性、持久穩定的基因表現
- 使用 CAG promoter，基因可持續高度表現於所有哺乳類細胞及 primary cells、stem cells
- 另有誘導性表現載體形式 (Cumate-inducible vector) 可供選擇
- 適合 iPSC reprogramming、gene therapy、表現蛋白或各種需要表現 target gene 的實驗
oriP/EBNA-1 會結合在宿主 chromatin 上，使載體與宿主 genome 同時複製。
隨著每一次細胞分裂，episomal plasmid 會自然減少 (最多 5%)，約 10-15 次細胞分裂後，幾乎所有的 episomal plasmid 都會消失。
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將 EEV 打到老鼠，Luciferase 高表現量持續 40 天