CRISPR-Cas9
CRISPR/Cas9 system
CRISPR/Cas9 system 最早是細菌用來抵抗病毒感染的防禦機制，若能在病毒感染的第一時間內就將其 DNA 降解，即可有效阻止病毒複製。現在被科學家廣為運用的是 Type II CRISPR/Cas9 system，只需要 Cas9 (核酸內切酶) 和 guide RNA (導引RNA) 形成複合體，利用 guide RNA 辨認 DNA，並引導 Cas9 切割特定序列的 DNA (位於 protospacer adaptor motif (PAM) 的上游 )，就可以輕鬆進行 gene knock-out 或 gene knock-in 等基因工程。
Cas9 在 guide RNA 的導引下，切割 target DNA 的位置在 PAM 的上游第 3 到 4 個 bp中間，產生 double-strand break，經由 non-homologous end joining (NHEJ) 的機制，將目標基因 knock out，或送入 donor vectors，進行 homologous recombination，將特定基因送入目標位置。而 SBI 提供不同型式的 CRISPR-Cas9 系統，以便應用於不同特性的細胞上，例如有 plasmid based、protein/RNA based 或者是 virus based。
如何建立 CRISPR/Cas9 system
最推薦以 RNPs (#CAS400A-KIT) 型式進行 CRISPR 實驗，與 vector-based 的 CRISPR 表現系統相比,送入 Cas9-sgRNA RNPs 至細胞內，可更有效地進行 gene-editing，並降低 off-target 影響 (Sander and Joung 2014)。此方法也被確認能有效的以 microinjection、electroporation 及 lipid- mediated transfection 成功送入並執行於多種細胞上 (Liang et al. 2015)。
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Purified Cas9 Protein
- cDNA 來自於 S. pyogenes wild type cas9，可以辨認的 PAM 為 NGG
- 具有 6x His tag－可利用 His antibody 確認和 SV40 nuclear localization signal(NLS)－確保Cas9 進入核作用
- 增加 gene editing 效率，有效降低 off-target 機率
- 可搭配 T7 gRNA Cloning and Production Kit
- 可應用於 Transfection of cells in vitro 、Embryo injection 、In vitro cleavage assay
T7 gRNA Cloning and Production Kit
- 提供 linearized T7 gRNA cloning vector 方便建構 T7 gRNA 載體
- 流程如下：
- 設計 gRNA =>一對 DNA oligos 為 target DNA PAM (NGG) 上游 20 nt，並 anneal DNA oligos 形成 duples。
- clone 至 linerized T7 gRNA vector 並 transform 及培養至 LB (Kanamycin plate)，挑出 positive clone 及定序確認。
- 用 EcoR1 線性化 positive clone 或 PCR 放大 T7 gRNA clone。
- 使用 in vitro transcription (IVT) 做出 gRNA。