Digital PCR 系統
Digital PCR 的原理
1990 年，Alec Morley 教授提出了 digital PCR 理論的雛型，亦即有限稀釋 PCR，並應用於白血病融合基因的檢測，直到 1999 年 Bert Vogelstein 教授發表了第一篇用 Digital PCR 來進行的研究，他將樣品稀釋到 single copy 的程度，並分配到獨立單元中進行擴增，使用螢光探針信號進行分析，並於當時闡述了檢測的極限跟反應的孔數相關，增加反應孔數可以更有效的提高突變檢出率，如果能通過更高通量比如 1536 孔板，檢測的靈敏度會更高，從而指出了現今 Digital PCR 的發展方向。
簡單來說，Digital PCR 是一種基於 PCR 反應 (DNA 聚合酶鏈鎖反應) 的單分子絕對定量技術。
第一代 PCR 技術：
Routine PCR
- 分子偵測靈敏度：100 copies
- 稀有突變偵測靈敏度：10-50%
- 操作環境：開放易汙染
第二代 PCR 技術：
Real-time PCR
- 分子偵測靈敏度：10 copies
- 稀有突變偵測靈敏度：1-5%
- 操作環境：封閉
第三代 PCR 技術：
Digital PCR
- 分子偵測靈敏度：1 copies
- 稀有突變偵測靈敏度：~0.01%
- 操作環境：封閉
在 Digital PCR 的過程中：
(1) PCR 反應體系 (含有螢光染料或探針) 被分割為數以萬計的均一微液滴。
(2) 其中部分微液滴內會含有一個或多個模板。
(3) 將這些微液滴收集到試管內進行 PCR 反應，其中含有模板的微液滴會產生擴增產物，由此具有較強的螢光，成為陽性微液滴。
(4) 在 PCR 反應完成後，依次對每個微液滴內的螢光進行檢測。
(5) 根據微液滴信號的峰值高度，繪製出微液滴螢光分佈的散點圖。
(6) 透過合理的螢光分類閾值，將微液滴內的螢光強度數位化，判斷出其中具有較強螢光的陽性微液滴視為“1”和具有較弱螢光的陰性微液滴視為“0”，並透過“1”和“0”的個數來實現絕對定量。
因此它與即時定量 PCR 不同，Digital PCR 不需要使用標準曲線，即可直接對核酸拷貝數的絕對值進行定量。
數據分析：
依據 Poisson distribution 數學模型計算陽性微滴可能含有 0、1、2、3、4……個 target gene。
根據 Poisson distribution 模型的計算公式：Copies per droplet（CPD）= - In (1-P)
其中 P = Npos / Ntotal
copies/ul=- In (1-P)/droplet volume = CDP/ droplet volume
範例如下：
使用 Digital PCR 分析的優勢
無須標準曲線的絕對定量
DNA/mRNA/miRNA/LncRNA
提高對抑制物的耐受程度
克服抑制物對定量結果的干擾
更高的檢測靈敏度
在高度 wild type 基因表現下的 <0.1% 突變行檢出率
更高的數據精準性
能辨別 1.1 倍以內的濃度變化
更好的數據再線性
對 target gene 含量的連續偵測
TargetingOne 推出優異的 Digital PCR 系統
TargetingOne 微液滴 Digital PCR 系統中儀器由液滴生成儀以及液滴分析儀所組成，並採用直觀式軟體操作介面可即時動態顯示實驗狀態，輕鬆簡單易上手，不需繁複訓練即可操作試驗。
液滴生成儀
- 樣本體積 30μL 可生成 5 萬液滴，8 樣品僅需 4 分鐘
- 生成的液滴自動至 8 連排管中，無需手動轉移液滴
液滴分析儀
- 8 個樣本偵測時間僅需 20 分鐘
- 準共焦光路，2 螢光通道 (FAM / VIC)
- 全封閉的檢測過程，防污染最高規格
- 專利準共焦光路，大幅提高靈敏度及準確性
TargetingOne Digital PCR 系統十大優點
採用全封閉系統，完全阻絕氣膠汙染疑慮。
超快速微液滴生成速度：< 5分鐘 / 8 樣本。
擴增方式不需綁定特定規格 PCR 儀器。
Hands-on 操作時間短、簡易，無需移液過程。
支援 Digital PCR 探針設計。
絕佳靈敏度可達 < 1%，能檢測 single copy 基因。
提供範圍最大反應體積。
超高有效液滴數：30 µL 反應體積下可檢測到至少 40,000 個有效微滴。
絕佳 CP 值，平均單個反應價位最低。
全機保固三年。
無論是在做稀有突變檢測、病原微生物檢測、NGS、環境檢測、基因編輯、基因表現分析、NIPT 或 CNV 分析的朋友，都可以藉由 Digital PCR 系統獲得更理想的結果！